細胞培養(yǎng)的步驟和注意事項

1、細胞復蘇
將凍存細胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內不斷搖動促進其融化。將融化的細胞移入離心管中，加入37℃預熱的DMEM完全培養(yǎng)基中（其中胎牛血清約為10%），輕輕吹勻，離心，500g離心2min，棄上清液。

加入DMEM完全培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)皿/瓶中，在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2、細胞傳代
當細胞密度達到80%~90%（過早產量不足，過晚細胞狀態(tài)不佳，1:2至1:10以上的比率傳代培養(yǎng)，一般1:3至1:5細胞一代，即從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間，非細胞有絲分裂次數）時，去掉完全培養(yǎng)基，用1X PBS清洗2次。

加入胰蛋白酶（注意：消化液的量以蓋住細胞最好，最佳消化溫度是37℃。顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度）進行消化，放入細胞培養(yǎng)箱中約2-3min。

加入適量DMEM完全培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，轉移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM完全培養(yǎng)基清洗，棄上清液。

加入DMEM完全培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，吸取10微升進行計數，然后按照所需細胞量在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

3、細胞凍存
當細胞密度達到80%~90%時，去掉完全培養(yǎng)基，用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶進行消化，放入細胞培養(yǎng)箱中約2-3min。加入DMEM完全培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，轉移至離心管后500g離心2min，棄上清液，再加入DMEM完全培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入lml凍存液（90%胎牛血清，10%DMSO。 一般來講血清含量可以在10%-90%之間調整，凍存液中加入血清一方面可以為細胞提供營養(yǎng)，另一方面可以在細胞凍存過程中提供非滲透性保護物質，如蔗糖，白蛋白等從而更好地保護細胞），放入凍存管內（管內有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入4℃冰箱中凍存30min，然后放入-20℃冰箱中凍存30min，再置于-80℃冰箱內過夜。

第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個月。 

細胞凍存和復蘇的原則是：慢凍速融，這樣更加有利于保持細胞的活力。凍存細胞不加任何保護劑，會導致細胞內冰晶的產生，從而使細胞產生內源性的機械損傷，引起細胞內環(huán)境滲透壓，PH，電解質等的改變，進而促使細胞死亡。

4、注意事項

（1）預熱培養(yǎng)用液：把已經配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱；
（2）用75%酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手；
（3）正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且減少污染；
（4）點燃酒精燈：注意火焰不能太??；
（5）嚴格的無菌操作；
（6）貼壁細胞消化適度：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養(yǎng)瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養(yǎng)細胞形態(tài)的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化；
（7）傳代細胞所有的操作盡量靠近酒精燈火焰。每次最好只進行一種細胞的操作，每種細胞使用一套器材。避免交叉感染；
（8）傳代細胞瓶口每次打開或者關閉都需要在酒精燈上消毒。